2024年10月30日，天津大学化工学院李锋/宋浩教授团队于Joule期刊发表题为“Electro-controlled distribution of reducing equivalents to boost isobutanol biosynthesis in microbial electro-fermentation of S. oneidensis”的论文，报道了一种能够直接响应胞内NADH/NAD + 比例的智能电控系统，通过电位调控异丁醇电发酵代谢通路，实现胞内还原力的高效定向分配。天津大学化工学院2019级蔚欢博士为论文第一作者，李锋副教授和宋浩教授为论文共同通讯作者。
微生物电发酵能够通过电极提供电子促进还原力再生，从而还原廉价底物转化为高能化学品，同时能够将还原力供给从中心代谢途径解耦，使得底物全部用于碳骨架合成，从而提高碳原子经济性，最终实现绿色循环可持续发展。微生物电发酵过程中，电子传递速率慢、还原力转化效率低、还原力能量定向分配特异性差仍是限制其规模化应用的主要瓶颈，先前的研究通过合成生物学策略和电极材料改造提高直接、间接以及界面电子传递速率，从而提高电合成效率。然而，细胞内还原当量及时、有效的供应和定向分布的研究却鲜有报告，还原力供给效率低和分配特异性差，大大降低了底物到产物的转化效率。
细胞内还原当量是细胞资源的重要组成部分。及时和适当地供应还原当量对于还原性产物的合成是必要的。另一方面，还原当量和代谢通量的定向分配对目标产品的最终产率也至关重要。然而，盲目提高细胞内NADH浓度可能会扰乱辅因子平衡并导致生长缺陷，从而不能提高化合物最终产量。此外，天然途径经常与目标途径竞争前体和还原当量，从而限制了所需化学品的总产率。因此，开发自主和动态控制调控网络，实现还原当量的高效和定向分配至关重要。之前的研究开发了基于氧化还原转录因子（如SoxR、OxyR、ArcA）和氧化还原分子（如绿脓菌素、过氧化氢、铁氰化钾、甲基萘醌等）的电调控系统，并结合CRISPR技术调控细胞行为和代谢网路，然而，直接响应胞内还原力分子的调控系统尚未开发。
在该研究中，作者首先构建了一株含有异丁醇电合成途径的希瓦氏工程菌，发酵产量达122mg/L。随后通过外加-0.6V电位进行电合成，产量达256mg/L。然而，由于过量供给还原力导致胞内氧化还原失衡，极大降低细胞存活率。因此，为了缓解氧化还原不平衡导致的细胞活力受阻，开发了一个双阶段电合成技术，即先+0.5V两天通过电极呼吸进行细胞生长和生物膜形成，再-0.6V十天进行电合成，将电发酵分为“细胞生长”和“产物合成”两个阶段，显著提高发酵过程中菌体量和存活率，并将产量提高至400mg/L。
图1：异丁醇合成途径的构建以及双阶段电发酵工艺的开发。
随后，为了解除+0.5V下异丁醇途径的过早表达带来的生长代谢负荷，作者进一步开发了一个响应NADH/NAD + 比例的生物传感器，即基于转录因子Rex的生物传感器，其对NAD + 和NADH具有不同的结合活性，与NAD + 结合时发挥转录抑制作用，与NADH结合时解除抑制，从而实现响应不同电位和NADH/NAD + 比例时基因的表达开关转换。基于此构建了电控基因表达系统，实现了异丁醇合成途径正电位开和负电位关。此电控系统进一步提高了电合成过程中细胞的存活率和电极生物量，促进了正电位生物膜形成和负电位的电子吸收速率，实现了负电位下还原力的高效供给，彻底解耦细胞生长和产物合成过程，将异丁醇产量提高至773mg/L，产率达到0.239g/g乳酸，是理论最高产率的58.1%。
图2：NADH/NAD + 生物传感器动态调控异丁醇合成实现还原力高效供给。
最后，为了实现还原力和碳源靶向异丁醇途径的定向分配，作者开发了一个电控CRISPR抑制系统（eCRISPRi），利用NADH传感器智能调控dCas9蛋白的表达，通过响应不同电位下NADH/NAD + 比例，实现在负电位下动态启动对还原力和前体竞争途径的抑制；并筛选了五个靶向基因，发现抑制丙酮酸裂解途径不仅能够减少副产物甲酸乙酸合成，还能降低NADH的消耗，最终将异丁醇的产率提高至1321mg/L，是出发菌株的10.8倍，同时产率达到0.394g/g乳酸，是出发菌株的10.4倍，并达到了理论最高产率的94.9%。
图3：电控CRISPRi转录抑制系统实现还原力靶向目标途径的定向分配。
该研究通过三种策略协同互补：策略一（双阶段电发酵工艺），策略二（引入NADH/NAD + 生物传感器）和策略三（电控CRISPR转录抑制技术）在希瓦氏菌中构建了一套智能电控系统，实现了异丁醇产量和产率的大幅提高，为微生物电发酵过程中还原力的高效定向供给提供了新策略。
图4：概念图和策略总结。
在该系统中，电极不仅可以作为电子源促进还原力再生，还能作为基因调控开关，实现还原力靶向目标途径的高效智能分配，为电调控和电遗传系统的进一步开发奠定了基础。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、天津市科技计划项目等基金的支持。（来源：科学网）
